免疫组化实验，结果老是达不到预期，怎么办？

自己做免疫组化 (IHC) 实验老是出问题，这是为什么啊？其实，不成功的原因会有很多，需要具体问题具体分析，今天，我们就和长沙实验外包公司慧登生物实验室一步步来看看！

一般的话，IHC实验流程包括样本固定、包埋、切片、脱蜡水化、抗原修复、灭活、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显色、复染、封片观察 12 个部分。

1、样本固定

步骤：

1）取材：对于组织块，不宜过大；（用生理盐水或 PBS 冲洗掉杂质，比如血液、体液）；

2）固定：将组织样本放入固定液中，（长沙实验外包公司慧登生物实验室提醒，一般固定液的量通常为组织体积的 10-20 倍，确保组织能够充分浸入固定液中）， 固定时间根据组织类型和实验要求而定，一般固定时间室温 18-24 h；

3）固定完成后，取出用流水冲洗，去除残留的固定液和可能产生的结晶。

2、包埋

步骤：

1）脱水：酒精梯度脱水；

2）透明：使用透明剂（长沙实验外包公司慧登生物实验室建议用二甲苯）来去除其中的酒精和其他溶剂，使组织样本变得透明；

3）浸蜡：将透明后的组织样本放入熔化的石蜡中，让石蜡充分渗透到组织样本中；

4）包埋：将浸蜡后的组织样本放入模具中，倒入熔化的石蜡，然后让石蜡冷却凝固。

3、切片

步骤：

1）包埋后的组织块已经充分冷却并固化，使用切片机进行切片；

2）接着，将切好的组织切片从刀上取下，并放在温水 (40℃) 中展开；最后再烤片机60℃ 烤片 2 h。

4、脱蜡水化

步骤：

1）脱蜡：切片首先被置于二甲苯中浸泡，以溶解和去除切片上的石蜡；

2）水化：依次置于无水乙醇 I、无水乙醇 II，95% 乙醇、85% 乙醇和 70% 乙醇中，各浸泡 1 次，5 min/ 次；再放入纯化水中清洗浸泡 5 min。长沙实验外包公司慧登生物实验室提醒，在整个脱蜡水化过程中，应确保切片始终保持在湿润的状态，不然容易出现高背景染色。

5、抗原修复

抗原修复的方法：这有微波热、水浴、高压热修复等多种方法。

6、灭活

7、封闭

步骤：

1）非特异位点封闭：将封闭液 (如 5% BSA 或血清等) 滴加到组织切片上，长沙实验外包公司慧登生物实验室提醒，确保封闭液均匀覆盖整个组织区域。然后将切片放入湿盒中，在室温或 37°C 下孵育 30 min，让封闭液与组织切片充分作用；

2）洗涤：封闭结束后，用 PBS 或 TBS 等缓冲液洗涤切片，以去除未结合的封闭液和可能存在的杂质。

8、一抗孵育

步骤：

1）选择一抗：根据实验目的选择特异性高、亲和力强的一抗；

2）稀释一抗：用适当的稀释液 (如 PBS、TBS 等) 稀释一抗；

3）涂覆一抗：将稀释好的一抗均匀涂覆在已封闭的组织切片上，确保抗体能够充分接触组织切片上的抗原；

4）孵育：将稀释好的一抗均匀滴加在已封闭的组织切片上，放入湿盒中，室温 (或 37°C) 孵育 1 h，使一抗与抗原充分结合。

9、二抗孵育

步骤：

1) 稀释二抗：用封闭液或其他适当的溶液稀释二抗；

2) 孵育二抗：将稀释好的二抗滴加在已经过一抗孵育并洗涤的组织切片上，室温孵育 30 min-60 min；

3) 洗涤：孵育完成后，使用洗涤液 (如 PBST 或 TBST) 在摇床上缓慢摇动洗涤切片，以去除未结合的二抗和其他杂质。洗涤通常需要重复几次，每次洗涤时间一般为 5-10 分钟。

10、显色

加入酶的底物，底物在酶的作用下发生化学反应，形成有色沉淀物。

11、复染

滴加 80-100 μL 苏木素染色液至完全覆盖组织，室温孵育 5 min，自来水冲洗返蓝。

12、封片观察

步骤：

1）脱水：切片依次使用 70%、85%、95% 乙醇、无水乙醇 I、无水乙醇 Ⅱ 分别浸泡 1 min；

2）透明：使用二甲苯浸泡两次，每次 1 min；

3）封片：封片剂 (如中性树胶、甘油明胶等) 滴在组织切片上，然后用盖玻片轻轻覆盖，长沙实验外包公司慧登生物实验室提醒，封片时要确保没有气泡产生，并且盖玻片与切片之间紧密贴合；

4）干燥。

好了，以上就是免疫组化 (IHC) 的实验步骤了，如果大家还有不明白的或者是需要实验协助指导的，也可以直接咨询长沙实验外包公司慧登生物实验室客服老师哦！